牛病毒性腹瀉病毒染料法熒光定量 RT-PCR 試劑盒

                           Bovine Viral Diarrhea Virus SYBR qRT-PCR Kit

產(chǎn)品及特點(diǎn)




牛 病 毒 性 腹 瀉 - 粘膜病 （ Bovine viral diarrhea-mucosal disease ， BVD-MD）是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus，BVDV）引起的以粘膜發(fā)炎、糜爛、壞死和腹瀉等特征為主的疾病。該病 在世界各地廣泛流行和傳播，一些畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家尤其嚴(yán)重。因此，BVDV 的 快速準(zhǔn)確鑒定，對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用。為此本公司開(kāi)發(fā)了本產(chǎn)品， 采用 qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)疑似感染動(dòng)物血清或組織中的 BVDV。它具有下列特點(diǎn)：

1. 一站式，用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對(duì)照。

2. 根據(jù)牛病毒性腹瀉病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物，具有良好的特異性。

3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測(cè)，靈敏度比常規(guī) RT-PCR 高 10-100 倍，可以達(dá) 到至少 1000 拷貝/反應(yīng)。

4. 使用一管式 qRT-PCR 技術(shù)，RT 和 PCR 兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成，不需要中 間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的 RT-PCR，只能用于科研，不能用于臨床。 

規(guī)格及成分

成分	編號(hào)	十孔盒包裝
2×qPCR MagicMix	A	500μL（棕色管）
熒光 PCR 專(zhuān)用模板稀釋液	B	1 mL（黃蓋）
牛病毒性腹瀉病毒PCR 引物混合物	C	100μL（白蓋）
牛病毒性腹瀉病毒PCR 陽(yáng)性對(duì)照(1×10E8 拷貝/μL)	D	50μL（紅蓋）
DNA 病毒裂解液（試用裝）	E	15 次（9 mL）
使用手冊(cè)	F	1 份

運(yùn)輸及保存： 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑 ：DNA 模板、10×ROX（根據(jù)機(jī)型決定，具體見(jiàn)使用方法）。

使用方法

一、稀釋 PCR 陽(yáng)性對(duì)照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）

1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。

2. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專(zhuān)用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。

4. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照到 5 號(hào)管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

8. 如果有N個(gè)樣品，必須設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?span lang="EN-US"> 10μL上步制備的PCR 陽(yáng)性對(duì)照的第4號(hào)（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬(wàn)拷貝）或第5號(hào)（濃度為1×10E5拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于10萬(wàn)拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。

9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。也可以選購(gòu)本公司的一管式病毒DNAout 或其升級(jí)版柱式病毒DNAout。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送15次一管式病毒DNAout。

三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）

10. 如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)

樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于PCR陽(yáng)性對(duì)照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。

11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：

成分	樣品管 N+2 個(gè)	PCR 陰性 對(duì)照管	PCR 陽(yáng)性 對(duì)照管（2-7 管）
2×qPCR MagicMix （棕色管）	10 μL	10 μL	各 10 μL
牛病毒性腹瀉病毒PCR 引物混合液（白蓋）	2 μL	2 μL	各2 μL
自備 10×ROX (見(jiàn)注)	2 μL	2 μL	2 μL
N+2 待測(cè)樣品 DNA 模板	6 μL	不加	不加
第 7 步所得 PCR 陽(yáng)性對(duì)照稀釋液（2-7 號(hào)）	不加	不加	各 6μL（2 號(hào)樣到 2 號(hào)管，3 號(hào)樣到 3 號(hào)管…）

注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對(duì)照，其他熒光PCR儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。

12. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

過(guò)程	溫度	時(shí)間
預(yù)變性	92℃	5 分鐘
PCR 反應(yīng)（35 個(gè)循環(huán)）	94℃	60 秒
	50℃	60 秒
	72℃	60 秒

13. 數(shù)據(jù)采集

具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合 DNA 時(shí)，最大吸收光譜在 471 nm，結(jié)合 DNA 時(shí)的最大吸收光譜在 500 nm，最大發(fā)射光譜在 530 nm。信號(hào)采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。

四、數(shù)據(jù)處理

14. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的log 值，再推算出其濃度。

15. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽(yáng)性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽(yáng)性。

特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

五、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論 ：

1、熒光定量PCR線性關(guān)系成立的條件分析 、熒光定量PCR線性關(guān)系成立的條件分析。

左圖橫坐標(biāo)是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是總的熒光強(qiáng)度Rn,改圖反映的是各個(gè)樣品隨著 左圖橫坐標(biāo)是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是總的熒光強(qiáng)度Rn,改圖反映的是各個(gè)樣品隨著 每輪PCR反應(yīng)，其總的熒光量的實(shí)時(shí)變化；右圖橫坐標(biāo)也是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是 每輪PCR反應(yīng)，其總的熒光量的實(shí)時(shí)變化；右圖橫坐標(biāo)也是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是 總的熒光強(qiáng)度與熒光本底的差值RT RB即△Rn的對(duì)數(shù)，在右圖中確定閾值線，該直 總的熒光強(qiáng)度與熒光本底的差值RT –RB即△Rn的對(duì)數(shù)，在右圖中確定閾值線，該直 線上所有樣品的RT RB的對(duì)數(shù)都相同，熒光定量PCR的線性關(guān)系才會(huì)成立。 線上所有樣品的RT –RB的對(duì)數(shù)都相同，熒光定量PCR的線性關(guān)系才會(huì)成立。